### 培养条件

细胞培养需要适宜的条件，以确保细胞的正常生长。建议的气相比例为95%的空气和5%的二氧化碳，培养温度设定为37℃。

### 传代方法

进行细胞传代时，建议使用1:2的比例进行第一次传代。在传代操作的前两天内，请及时更换培养基。如同时购买培养基，可享受更多优惠。

在收到细胞后，不要立即打开瓶盖。请先核对培养瓶上标注的细胞名称是否与订购的商品一致，同时检查是否存在破损或泄漏情况。如果未发现异常，用显微镜观察细胞生长状况，并拍摄不同放大倍数的照片（建议拍摄40x、100x、200x的各一张），前3天的照片是售后服务的重要依据。若未提供照片，则默认为收到的细胞状态良好。

### 贴壁细胞传代步骤

1. 弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS洗涤细胞1-2次。

2. 加入约1-2ml的0.25%胰蛋白酶消化液至培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟。观察细胞是否大部分变圆并脱落，迅速取回在操作台，轻轻敲击培养瓶后加入5ml以上的完全培养基以终止消化。

3. 轻吹细胞使其完全脱落后吸出，并将悬液转移至15ml离心管中，以1000RPM离心5分钟，弃去上清液，加入1-2ml完全培养基重悬细胞。

4. 按1:2的比例分瓶传代，将新的完全培养基补充至5-8ml每瓶，最后放入37℃、5%CO2的细胞培养箱进行培养。

### 悬浮细胞传代步骤

1. 进行半换液法处理，竖立培养瓶在培养箱内静置约1小时，轻轻吸出3ml左右的培养基，再补充3ml的完全培养基。如果培养基变色较慢，可以直接加入约500ul的FBS。在传代时可以直接添加5ml的培养基，通常经过3次这种传代后，可以进行一次离心以去除死细胞。

2. 对于离心换液法，如果需要分瓶，将细胞悬液收集至离心管中进行1000RPM离心5分钟，弃去上清后加入1-2ml培养液重悬，然后按1:2的比例分到新T25瓶中，添加6-8ml新的完全培养基，确保细胞生长活力。

### 细胞冻存步骤

1. 当细胞生长到覆盖培养瓶80%时，移除培养液，用PBS清洗细胞一次。

2. 加入约1ml的0.25%胰蛋白酶消化液，观察细胞变圆后加入5ml完全培养基以终止消化，轻轻吹打以使细胞脱落，将悬液转移至15ml离心管并以1000RPM离心5分钟。

3. 弃去上清，将沉淀的细胞加入1ml无血清冻存液（货号：C7001），混匀后转入冻存管中。

4. 将冻存细胞直接放入-80℃冰箱。如果后续需要转入液氮罐，应在-80℃冰箱存放至少24小时后再转入液氮罐。

### 细胞复苏步骤

1. 从液氮中取出冻存管（请佩戴防护面具），快速移入37℃水浴中解冻，直到冻存管中无晶体形成，然后用75%酒精清洁冻存管外壁。

2. 将管内细胞转移至含5ml完全培养基的15ml离心管中，1000RPM离心5分钟。

3. 弃去上清，沉淀细胞后用5ml完全培养基重悬，接种至T25培养瓶中，并放入37℃、5%CO2的细胞培养箱中进行培养。

4. 第二天更换为新鲜完全培养基继续培养。

### 注意事项

细胞在运输过程中可能会有脱落现象，这是正常的。如果有较多细胞脱落，可以将培养瓶内的培养液收集到离心管中，1000RPM离心5分钟，收集的上清可用于过渡培养（后续对比），沉淀后加入1-2ml胰蛋白酶轻轻吹打，重悬并消化1-2分钟后，再加入5ml完全培养基终止反应。再次离心，去除上清，加入1-2ml完全培养基重悬。然后按1:2比例分瓶传代，并添加新的完全培养基至5-8ml每瓶，最后放入37℃、5%CO2的培养箱中继续培养。

### 常见问题及处理方案

在运输过程中若发生细胞丢失、瓶身破损或培养液漏液等问题，可以申请重发。若细胞在收到产品48小时内发现污染，请提供真实实验结果以便核实后重发。此外，如细胞运输后活性下降，需在收到后24小时内提供清晰照片以支持重发申请。任何由于客户操作不当或非推荐培养体系导致的细胞问题，我们将不予重发，具体情况可沟通协商。

人生就是博-尊龙凯时致力于提供优质的细胞培养解决方案，确保您在生物医学研究中取得成功！